PEWARNAAN
4.1.1. PEWARNAAN NEGATIF
· Tujuan : Untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana
· Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi untuk mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.
· Metode ini meliputi pencampuran M.O. didalam setetes tinta India (Nigrosin) lalu menyebarkannya diatas sebuah kaca obyek.
· M.O tampak transparan & tampak jelas diantara medan yang gelap.
· Tidak mengalami pemanasan
PEWARNAAN SEDERHANA
Tujuan : Mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel dan kelilingnya dan mengamati ciri-ciri tertentu mikrobe
· Sel-sel M.O. yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang bila diamati dengan mikroskop cahaya.
· Pewarna yang digunakan adalah satu jenis warna.
· Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana karena sitoplasma basofilik (suka akan basa)
· Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe mofrologi (kokus, basilus, vibrio, spirilum)
PEWARNAAN GRAM
· Tujuan : Melakukan prosedur pewarnaan gram, memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur, memahami reaksi kimiawi didalam prosedur tersebut.
PEWARNAAN INI MERUPAKAN SALAH SATU YANG DIGUNAKAN UNTUK KLASIFIKASI BAKTERI
· Organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap/ungu) à disebut Gram Positif.
· Organisme yang kehilangan komplek warna ungu pada waktu pembilasan alkohol namun kemudian terwarnai dengan pewarna tandingan safranin sel-sel tampak merah muda à gram negatif.
KUANTIFIKASI MIKROBA
1. Hitungan mikroskopis langsung, menggunakan alat hemasitometer
2. Hitungan cawan (plate count)
3. Pengukuran massa sel (turbidimetrik)
B.
GUNA PEMIARAAN (KULTUR) BAKTERI
Untuk menggampangkan pemeriksaan perlulah diadakan pemiaraan atau biakan bakteri, sehingga sewaktu-waktu perlu, bakteri itu selalu tersedia. Piaraan dapat disimpan di dalam almari es untuk waktu yang lama.
1. PIARAAN CAMPURAN, PIARAAN MURNI
Supaya kita mendapatkan satu spesies saja dalam satu piaraan, maka perlulah diadakan suatu piaraan murni (pure culture). Piaraan murni dapat diperoleh dari piaraan campuran (mixed culture) dengan cara sebagai berikut.
Kalau kita pertama kali mengadakan piaraan, biasanya yang kita peroleh itu suatu piaraan campuran. Misal, kita ambil bahan (sampel) dari udara, dari tanah, dari kotoran; kalau bahan itu kita sebarkan pada medium steril, akan tumbuhlah beraneka koloni yang masing-masing mempunyi sifat-sifat yang khas. Jika kita mengambil bahan dari salah satu koloni tersebut, kemudian bahan itu kita tanam pada medium baru yang steril, maka bahan itu akan tumbuh menjadi koloni yang murni, asalkan pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat menurut teknik aseptik, yaitu menggunakan alat-alat yang steril dan aturan-aturan laboratorium tertentu. Piaraan yang kita peroleh dengan jalan demikian kita sebut piaraan pertama (primary culture), dan sifatnya murni. Piaraan semacam ini dapat disimpan, tetapi tiap-tiap waktu tertentu harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru. Piaraan-piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama disebut piaraan turunan (sub-culture).
Tiap-tiap laboratorium perlu menyimpan beberapa jenis piaraan murni. Negara-negara yang sudah maju mesti mempunyai koleksi pelbagai piaraan murni; piaraan simpanan itu disebut juga “stock culture”.
Ada piaraan species bakteri yang sewaktu-waktu, yaitu tiap 2 atau 3 bulan sekali, perlu diremajakan, meskipun piaraan itu selalu disimpan di dalam almari es. Untuk meremajakan piaraan itu caranya sama dengan yang telah diceritakan di atas yaitu dengan memindahkan “bibit” dari koloni yang lama kepada medium yang baru. Setelah tanaman baru itu dibiarkan tumbuh beberapa jam dalam temperatur biasa (25o – 27o C), koloni baru ini dimasukkan dalam almari es, untuk diperbaharui 2 atau 3 bulan lagi.
Cara lain untuk menyimpan piaraan murni ialah dengan jalan liofilisasi yang prosedurnya sebagai berikut. Bakteri ditanam didalam air susu yang tidak mengandung lemak atau di dalam serum yang steril. Setelah tumbuh, diambillah 0,1 ml dari medium tersebut untuk dimasukkan ke dalam botol-botol kecil (ampul) yang dari dalam telah dilapisi dengan alkohol yang mengandung CO2 yang kental (temperatur -78oC). Kemudian leher botol itu dipijarkan sehingga tertutuplah botol berisi bakteri itu. Dalam keadaan demikian ini bakteri dapat disimpan sampai bertahun-tahun, asal selalu ada dalam 4oC.
2. DASAR MAKANAN (MEDIUM ATAU SUBSTRAT)
Berupa apakah makanan bakteri itu? Dasar makanan yang paling baik bagi pemiaraan bakteri ialah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan, atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium ialah kaldu cair dan kaldu agar. Medium ini tersusun daripada:
Kaldu bubuk 3 g
Pepton 5 g
Air suling 1000 g
Jika diperlukan medium padat, maka kepadanya ditambahkan 15 g agar-agar. Medium ini disebut medium baku. Untuk keperluan penelitian yang berhubungan dengan serologi perlu ditambahkan 5 g NaCl.
Jika tidak ada kaldu bubuk, bahan itu dapat diganti dengan rebusan daging yang diperoleh sebagai berikut: Ambil barang 0,5 kg daging yang tidak berlemak, rendam dalam 1.000 ml air suling semalam-malaman dalam almari es. Paginya buanglah lemak yang mungkin terdapat mengapung di permukaan air. Kemudian peraslah suspensi lewat kain mori yang halus. Tambahkan air suling kepada filtrat sehingga volume menjadi 1 liter lagi. Kepada medium ini ditambahkan 5 g pepton dan lain-lainnya yang diperlukan, lalu panasi suspensi sampai 100oC selama 20 menit. Akhirnya tuangkanlah suspensi lewat kertas saring, dan tambahkan air suling lagi sehingga volume tetap 1 liter. Medium ini perlu disterilkan dahulu sebelum digunakan untuk memiara bakteri. Juga keasaman medium perlu diatur, biasanya pH 7.
Untuk mengetahui jenis-jenis medium yang lain, yang berkepentingan dipersilakan membaca buku-buku praktikum mikrobiologi atau bakteriologi.
Selanjutnya medium buatan manusia itu dapat berupa:
A. MEDIUM CAIR
Medium cair yang dipakai ialah kaldu yang disiapkan sebagai berikut. Kepada 1 liter air murni ditambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g pepton. Pepton ialah protein yang terdapat pada daging, pada air susu, pada kedelai, dan pada putih telur. Pepton mengandung banyak N2, sedang kaldu berisi garam-garam mineral dan lain-lainnya lagi. Medium itu kemudian ditentukan pHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral; keadaan yang demikian ini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti tersebut di atas masih perlu disaring untuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi atau botol-botol. Penyaringan dapat dilakukan dengan kertas saring. Setelah tabung atau botol berisi medium kaldu tersebut disumbat dengan kapas, dapatlah mereka dimasukkan ke dalam alat pensteril (autoklaf).
B. MEDIUM KENTAL (PADAT)
Dahulu kala orang lazim menggunakan kentang yang di potong-potong serupa silinder untuk medium. Silinder kentang mentah dibuat dengan pipa besi, lalu potongan-potongan itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian tabung disumbat dengan kapas, dan setelah itu disterilkan di dalam autoklaf. Setelah kentang dingin kembali, permukaan atas dari silinder kentang dapat ditanami bakteri.
Suatu penemuan yang baik sekali ialah medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Setelah medium itu disterilisasikan, dan kemudian dibiarkan mendingin, maka kita perolehlah medium padat. Gelatin dapat juga dipakai sebagai bahan pengental – dan memang dahulu orang biasa memakainya – tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar. Agar-agar baru mencair pada suhu 95oC, sedangkan gelatin sudah mencair pada suhu 23o C. Dengan demikian medium yang mengandung gelatin perlu disimpan dalam tempat yang lebih dingin daripada temperatur kamar, jika dikehendaki medium tersebut tetap dalam keadaan padat.
Agar-agar ialah sekedar zat pengentai, dan bukan zat makanan bagi bakteri. Gelatin sebaliknya dapat diencerkan oleh enzim-enzim bakteri. Gelatin diperoleh dari rebusan tulang-tulang, jadi gelatin itu zat serupa perekat.
C. MEDIUM YANG DIPERKAYA
Kebanyakan bakteri suka tumbuh pada dasar makanan seperti disebut di atas. Tetapi bakteri patogen seperti Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis, Diplococus pneumoniae, dan Neisseria gonnorhoeae memerlukan zat makanan tambahan berupa serum atau darah yang tak mengandung fibrinogen lagi. Fibrinogen adalah zat yang menyebabkan darah menjadi kental, apabila keluar di luka. Serum atau darah itu dicampurkan ke dalam medium yang sudah disterilkan. Jika pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serum atau darah tersebut akan mengental akibat pemanasan. Pada medium buatan Loeffler, serum dicampurkan di dalam dasar makanan sebelum sterilisasi. Medium ini baik sekali untuk memiara basil-basil dipteri. Juga medium yang memerlukan tambahan putih telur dibuat dengan cara demikian. Sering kali orang menambahkan susu atau air tomat kepada dasar makanan untuk menumbuhkan Lactobacillus dan beberapa spesies lainnya.
D. MEDIUM YANG KERING
Pekerjaan laboratorium sekarang ini banyak dipermudah dengan telah adanya bermacam-macam medium yang tersedia dalam bentuk serbuk kering. Untuk menyiapkan medium tersebut, cukuplah orang mengambil sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian liter air dan kemudian larutan itu disterilkan. Penentuan pH tidak perlu lagi, karena hal itu sudah dilakukan lebih dulu pada pembuatan serbuk. Periksalah “Difco Manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and clinical laboratory procedures”.
E. MEDIUM YANG SINTETIK
Medium sintetik berupa ramuan-ramuan zat anorganik yang tertentu yang mengandung zat karbon dan nitrogen. Bakteri autotrof dapat hidup dalam medium ini. Bakteri saprofit (istilah lain untuk ini ialah saprobakteri) dapat juga dipiara di dalam medium ini asalkan kepada medium ini ditambahkan natrium sitrat dan natrium amonium fosfat; yang pertama merupakan sumber karbon, sedang yang kedua merupakan sumber nitrogen. Medium ini buatan Koser, dan medium ini berguna untuk membedakan Aerobacter aerogenes dari Escherichia coli; yang pertama dapat hidup dalam medium ini, sedang yang kedua tidak. Medium yang hanya cocok untuk spesies-spesies tertentu, dan tidak cocok untuk spesies-spesies yang lain, itu disebut medium selektif.
Medium sintetik itu umumnya dibuat secara eksperimental. Medium ini tidak menimbulkan zat-zat penolak, apabila masuk tubuh hewan atau manusia. Selanjutnya medium sintetik itu berguna sekali sebagai medium dasar dalam penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan tentang ada tidaknya zat-zat tertentu dengan menggunakan mikroorganisme itu disebut analisis zat jadi atau bio-assay.
3. STERILISASI MEDIUM DAN ALAT-ALAT
Kita semua dapat memaklumi, andaikata medium dan alat-alat yang kita pergunakan dalam inokulasi itu tidak steril, niscayalah kita tidak akan mungkin memperoleh piaraan bakteri yang kita inginkan. Maka langkah-langkah pertama yang harus kita ambil sebelum kita mengadakan inokulasi ialah mengusahakan sterilnya medium serta alat-alat perlengkapannya. Lagi pula, kita harus menguasai teknik inokulasi.
BEBERAPA CARA UNTUK MENSTERILKAN MEDIUM
a. Dalam aba 18 orang mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan medium tersebut selama beberapa jam. Dengan jalan ini maka matilah semua benih kehidupan. Cara yang demikian ini dilakukan oleh Spailanzani (1729 – 1799) untuk membuktikan tidak mungkinnya abiogenesis.
b. Tyndallisasi. Metode ini berupa mendidihkan medium dengan uap untuk beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari – selama itu spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetatif – maka medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan sekali lagi. Dengan jalan demikian ini diperolehlah medium yang steril, dan lagi pula, zat-zat organik yang terkandung di dalamnya tidak mengalami banyak perubahan seperti halnya pada (a).
c. Dengan autoklaf, yaitu alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Medium yang akan disterilkan ditempatkan di dalam autoklaf ini selama 15 sampai 20 menit; hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya barang yang perlu disterilkan. Medium yang akan disterilkan itu lebih baik ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpul dalam satu botol yang agak kecil daripada dikumpul dalam satu botol yang besar. Setelah pintu autoklaf ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka, dan temperatur akan terus menerus naik sampai 121o C. Biasanya autoklaf sudah diatur demikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan ada sebesar 15 lbs (pounds) per inch persegi yang berarti 1 atmosfer per 1 cm2. Perhitungan waktu 15 atau 20 menit itu dimulai semenjak termometer pada autoklaf menunjuk 121oC. Setelah cukup waktu, maka kran uap ditutup, dan dengan demikian akan kita saksikan, bahwa suhu mulai turun sedikit demi sedikit, demikian pula manometer. Autoklaf tidak boleh dibuka sekonyong-konyong. Jika diperbuat demikian, maka isi botol yang ada di dalam autoklaf akan meluap ke mana-mana. Baiklah kita menunggu sampai manometer menunjukkan 0, barulah autoklaf kita buka. Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit. Jika medium mengandung vitamin, gelatin atau bangsa gula, maka setelah sterilisasi sependek-pendeknya dalam autoklaf, medium tersebut haruslah segera didinginkan sesudahnya dikeluarkan dari autoklaf. Perbuatan ini perlu untuk menghindarkan terurainya zat-zat tersebut. Medium yang sudah steril dapat disimpan dalam almari es.
Gambar Prinsip suatu autoklaf. Di sini uap air diperoleh langsung dari air yang mendidih dalam periuk, tidak dari sumber lain lewat pipa yang ada krannya.
d. Dengan penyaringan (filtrasi). Medium disaring dengan saringan porselin atau dengan tanah diatom. Dengan jalan ini, maka zat-zat organik tidak akan mengalami penguraian sama sekali. Hanya sayang, virus tak dapat terpisah dengan penyaringan, medium masih perlu dipanasi dalam autoklaf, meskipun tidak selama 15 menit dengan temperatur 121o C. Penyaringan dapat dilakukan juga dengan saringan yang dibuat dari asbes. Saringan ini lebih murah dan lebih mudah penggunaannya daripada saringan porselin. Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan saringan porselin terlalu mahal untuk dibuang, dan terlalu sulit untuk dibersihkan.
PENSTERILAN GELAS-GELAS
Gelas, botol, pipa, pipet yang sudah bersih tidak disterilkan di dalam autoklaf, karena barang-barang tersebut akan tetap basah sehabis sterilisasi. Alat-alat dari gelas dimasukkan di dalam oven kering selama 2 – 3 jam pada temperatur 160o – 170o C; hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan dalam oven. Kapas masih dapat bertahan dalam oven kering selama waktu dan pada temperatur seperti tersebut di atas. Alat-alat yang belum bersih dan belum kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering.
Pensterilan alat-alat dapat pula dilakukan dengan gas etilen oksida. Hal ini harus dikerjakan dengan hati-hati, karena ada bahaya letusan.
4. PENANAMAN BAKTERI (INOKULASI)
Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru minta banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut-paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril; ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan.
A. MENYIAPKAN RUANGAN
Ruang tempat inokulasi itu kecil, bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir-butir debu menempel kepadanya. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali jika meja tempat inokulasi itu didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan juga di dalam suatu kotak berkaca (ent-kas). Dalam laboratorium untuk membuat vaksin, serum dan sebagainya, udara yang masuk ke dalam ruangan itu dilewatkan saringan yang disinari dengan sinar ultra-ungu.
B. PEMINDAHAN DENGAN KATA INOKULASI
Ujung kawan inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung itu boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1 – 3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (yaitu sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.
C. PEMINDAHAN DENGAN PIPET
Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau pada penyelidikan susu. Untuk itu diambillah 1 ml contoh untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang steril. Kemudian diambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur-adukkan dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair (suhu antara 42 – 45oC). Lalu agar-agar yang masih encer ini dituangkan di cawan Petri. Setelah agar-agar membeku, maka cawan Petri yang berisi piaraan baru itu disimpan dalam tempat yang aman, misalnya di dalam almari atau di dalam laci. Penyimpanan cawan dilakukan dengan meletakannya secara terbalik, yaitu permukaan medium menghadap ke bawah; ini untuk menghindari tetesnya air yang mungkin melekat pada dinding dalam pada tutup cawan. Piaraan yang diperoleh dengan jalan seperti disebut di atas ini terkenal sebagai piaraan adukan. Dengan cara yang demikian ini bakteri yang diinokulasikan tadi dapat menyebar luas ke seluruh medium. Bakteri yang aerob maupun yang anaerob dapat tumbuh di situ, dan banyaknya koloni dapat dihitung dengan mudah.
Pengenceran 1 ml sampel dengan 99 ml air murni itu tidak mutlak, hal ini tergantung kepada keadaan air atau susu yang akan diselidiki.
